Ključ Edmanovog sekvenciranja je reagens fenilizotiocijanat (PITC), koji se naziva Edmanov reagens. Kada N-terminus proteina nije blokiran, PITC lako stupa u interakciju sa N-terminalnim ostatkom peptida pri alkalnom pH, stvarajući tako derivat feniltiokarbamoil aminokiseline. Bez uništavanja peptidnih veza drugih ostataka u sekvenciranom peptidu, N-terminalna sekvenca se može precizno odrediti uklanjanjem i identifikacijom označene N-terminalne aminokiseline. Kada je N-kraj proteina cikliziran i blokiran, -amino grupa na N-terminusu je modificirana (-amino acetilacija, metilacija, piroglutamat, itd.), što rezultira nedostatkom slobodnih -amino grupa na N- terminus, što rezultira nesposobnošću PITC-a da se stvarno veže za protein, i na kraju onemogućava da se Edmanova reakcija razgradnje odvija direktno. Stoga, Edmanovo sekvenciranje ima određena ograničenja.
Ako je N-terminus hemijski modificiran ili se susreću ne- -aminokiseline, sekvenciranje Edman degradacije se ne može koristiti. Za blokiranje N-terminala, uzorci koji ispunjavaju zahtjeve mogu se odabrati prema specifičnoj situaciji (50% N-krajeva prirodnog proteina je modificirano u prirodi, a uobičajene modifikacije uključuju acetilaciju, metilaciju, piroglutamat, itd.); ako je N-kraj blokiran zbog reakcije deterdženata ili kemikalija u otopini s funkcionalnim grupama N-kraja uzorka proteina, ili je pH vrijednost otapala korištenog za odvajanje i pročišćavanje previsoka, odaberite odgovarajući enzim za uklanjanje modifikacije N-kraja proteina ili korištenje masene spektrometrije za identifikaciju modifikacije N-kraja; ako je poznata modifikacija koja uzrokuje N-blokiranje proteina, odgovarajuća proteaza se može koristiti za uklanjanje modifikacije N-kraja, a zatim se Edmanova reakcija degradacije može koristiti za sekvenciranje.
Trenutna Edmanova tehnologija sekvenciranja može mjeriti samo 30-60 sekvencu aminokiselinskih ostataka N-kraja proteina, što ograničava analizu i određivanje proteinske sekvence pune dužine. Naravno, Edmanovo sekvenciranje se takođe može koristiti za analizu proteinske sekvence pune dužine prethodnom obradom uzorka proteina. Prvo, protein se isječe na više kratkih peptida pomoću proteaze, a zatim se kratke peptidne sekvence mjere u sekvenci koristeći Edmanovu metodu sekvenciranja. Konačno, sekvenca proteina pune dužine može se izmjeriti spajanjem sekvence.
Edmanovo sekvenciranje se obično ne koristi za određivanje lokacije disulfidnih veza, a propusnost je mala, pa je nemoguće analizirati više proteina istovremeno. Prednosti identifikacije masenom spektrometrijom i Edmanovog sekvenciranja mogu se kombinirati kako bi se postigla visoka propusna identifikacija proteina i precizno određivanje sekvence.