Faza denaturacije
Tokom ove faze koktel koji sadrži šablon DNK i sve ostale osnovne sastojke zagrijava se na 94-95⁰C.
Visoka temperatura uzrokuje vodonične veze?između baza u dva lanca DNK šablona da se prekine i da se dva lanca razdvoje.
Ovo rezultira dva pojedinačna lanca DNK, koji će djelovati kao šabloni za proizvodnju novih lanaca DNK.
Važno je da se temperatura u ovoj fazi održava dovoljno dugo kako bi se osiguralo da su se lanci DNK potpuno razdvojili.
Ovo obično traje između 15-30 sekundi.
Faza žarenja
Tokom ove faze reakcija se ohladi na 50-65⁰C. Ovo omogućava prajmerima da se vežu na određeno mesto na jednolančanoj šablonskoj DNK putem vodonične veze (tačna temperatura zavisi od temperature topljenja prajmera koje koristite).
Prajmeri su pojedinačni lanci DNK ili RNK?sekvence koje su dugačke oko 20 do 30 baza.
Prajmeri su dizajnirani da budu komplementarni?u nizu do kratkih dijelova DNK na svakom kraju sekvence koju treba kopirati.
Prajmeri služe kao polazna tačka za sintezu DNK. Enzim polimeraza može samo dodati DNK baze u dvostruki lanac DNK. Tek kada se prajmer veže, enzim polimeraze može se vezati i početi stvarati novi komplementarni lanac DNK od labavih baza DNK.
Dva odvojena lanca DNK su komplementarna i idu u suprotnim smjerovima (od jednog kraja – 5' kraja – do drugog – 3' kraja); kao rezultat, postoje dva prajmera – prednji prajmer i reverzni prajmer.
Ovaj korak obično traje oko 10-30 sekundi.
Produžena faza
Tokom ovog završnog koraka, temperatura se povećava na 72⁰C kako bi se omogućilo stvaranje nove DNK pomoću posebnog enzima Taq DNK polimeraze koji dodaje baze DNK.
Taq DNK polimeraza je enzim uzet iz bakterija koje vole toplinu? Thermus aquaticus.
Ova bakterija inače živi u toplim izvorima pa može podnijeti temperature iznad 80⁰C.
DNK polimeraza bakterije je vrlo stabilna na visokim temperaturama, što znači da može izdržati temperature potrebne da se lanci DNK razdvoje u fazi denaturacije PCR-a.
DNK polimeraza iz većine drugih organizama ne bi mogla izdržati ove visoke temperature, na primjer, ljudska polimeraza radi idealno na 37˚C (tjelesna temperatura).
72⁰C je optimalna temperatura za Taq polimerazu za izgradnju komplementarnog lanca. Veže se za prajmer, a zatim dodaje baze DNK u jedan lanac jednu po jednu u smjeru 5' do 3'.
Rezultat je potpuno novi lanac DNK i dvolančana molekula DNK.
Trajanje ovog koraka zavisi od dužine sekvence DNK koja se amplificira, ali obično traje oko jedan minut da se kopiraju 1,000 DNK baze (1Kb).
Ova tri procesa termičkog ciklusa se ponavljaju 20-40 puta kako bi se dobilo mnogo kopija DNK sekvence od interesa.
Novi fragmenti DNK koji se prave tokom PCR-a služe i kao šabloni za koje se enzim DNK polimeraza može vezati i početi stvarati DNK.
Rezultat je ogroman broj kopija specifičnog segmenta DNK proizvedenih u relativno kratkom vremenskom periodu.